本发明公开了一种三层纳米孔薄膜及其制备方法和应用。本发明制备方法包括如下步骤：提供一块基板，在基体两侧表面沉积Si3N4/SiO2双层纳米薄膜，在顶层SiO2薄膜上沉积一层Si3N4薄膜，刻蚀基体一侧薄膜形成基体释放窗口，刻蚀基板得到三层纳米薄膜，采用反应离子刻蚀从基体释放窗口刻蚀Si3N4薄膜减薄，得到悬空的三层纳米薄膜结构，使用氦离子束刻蚀出三层纳米通孔。本发明的三层纳米孔薄膜的制备方法先沉积形成Si3N4/SiO2层，再采用原子层沉积或分子气相沉积形成Si3N4顶层，各层厚度均匀可控，层间接触平整，薄层质量稳定，制备方法操作简单，无需沉积层减薄，提高了生产效率，节约了生产成本。